文丨王律法谈

编辑丨王律法谈

椰子是一种热带棕榈作物，因其椰水清甜清爽，椰肉香甜浓郁，常被作为水果鲜食，香水椰子是泰国绿矮椰子的自然突变品种，因其具有独特的芋香气味而深受消费者喜爱。

目前已有研究确定，香水椰子中的芋香气味是由于香水椰子中甜菜碱醛脱氢酶外显子的第14个碱基发生了G到C单碱基突变，该位置丙氨酸变为脯氨酸。

使得氨基醛脱氢酶活性降低，导致香水椰子中的2-乙酰基-1-吡咯啉大量积累所致，但BADH2基因的上游调控机制还尚不明确。

酵母单杂交体系由Wang和Reed于1993年创立，经过多年的发展，现已成为研究转录因子的重要技术手段。
酵母单杂交技术可以根据转录因子和基因启动子顺式作用元件结合，进而调控报告基因表达的原理。

筛选已知目的基因的上游转录因子，目前已通过酵母单杂交体系筛选出许多转录因子。
如:拟南芥脱水响应元件DRE/CRT的转录因子DRE。

拟南芥脱水应激基因ERD1的NAC转录因子ANAC019、ANAC055、ANAC072，锌指转录因子ZFHD1等。

本研究采用Gateway方法构建椰子酵母单杂交cDNA核文库，通过酵母单杂交技术筛选BADH2基因的上游调控因子并进行验证。

为进一步解析香水椰子香味的调控机理和优良香水椰子品种的育种提供分子基础。

试验材料

采用香水椰子品种‘文椰4号’为材料，来源中国热带农业科学院椰子研究所国家棕榈种质资源圃，采成龄香水椰子树叶片、9个月果、雌花和雄花，将叶片、果肉、雌花和雄花剪碎混合后放入-80℃液氮速冻。

采用Trizol法提取香水椰子RNA，并用1.5%琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度计检测RNA质量及浓度，最后用Oligo磁珠纯化mRNA。

使用MMLV逆转录酶，使用逆转录引物，将RNA逆转录成cDNA。
再使用三框引物扩增cDNA后用DNACleanBeads和Oligo磁珠纯化cDNA。

用均一化试剂盒均一化cDN，使用小片段去除试剂盒进行小片段去除。

诱饵载体转化及酵母菌株自激活检测

使用高纯度质粒大提试剂盒提取pHIS2-BADH2-pro诱饵质粒，加入50%聚乙二醇240μL，1mol/L醋酸锂36μl，10mg/mL单链DNA5μl，诱饵质粒5μL，Y187感受态细胞50μL进行转化。

每个转化用200μL无菌水悬浮菌体混匀，涂布相应的缺陷型转化平板培养，分别从转化反应的平板上各随机挑取3个单菌落，稀释后涂板至对应的添加不同浓度3-氨基-1，2，4-三唑的缺陷型平板上，同时设置pHIS-p53+pGAD53m阳性对照，30℃恒温培养3d。

用含有正确pHIS2-BADH2-pro诱饵质粒的Y187酵母转化子作为受体菌，加入50%聚乙二醇9.6mL，1mol/L醋酸锂1.44mL，10mg/mL单链DNA300μL，文库质粒25μg，Y187感受态细胞25μg进行转化。

将文库质粒pGADT7-cDNA转入其中，从中取20μl培养物进行梯度稀释后涂SD-TL平板，用于检测文库转化效率，其余涂SD-平板，30℃培养3~4天，观察转化结果，将SD-筛库平板上长出的初始阳性转化子划线于SD-选择平板。

酵母单杂交核文库质量检测

从电转孵育后的菌液中吸取10μL稀释10000倍，取100μL涂布于含氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置过夜培养，第二天取出平板后，划线把平板平均分成4份。

数其中一份的克隆数目，约为124个，得到平板上克隆约为496个，计算得到库容为4.96×107，总克隆数为9.92×10，重组率为100%，文库基因覆盖度较好。

从平板上随机挑选24个克隆，用T7-F/AD-R引物进行菌落PCR，PCR结束后取5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，由图可知泳道条带在1000bp上下出现，文库基因长度较为完整。

通过PlantCARE和PlantPAN3.0在线预测工具对BADH2基因启动子序列进行顺式作用元件预测分析，共预测到AP2F、AT-HOOK、BHLH、bZIP、Dof、SBP、ZF-HD、MYB、YABBY、WRKY共10种顺式作用元件，各元件功能及序列信息。

pHIS2-BADH2-pro载体构建

将人工合成的BADH2基因的启动子序列构建到pHIS2载体的EcoRI/SacI酶切位点上，获得pHIS2-BADH2-pro载体，电击转化TOP10感受态细胞，培养后测序验证，提取200~1000ng质粒，37℃下消化约30~60min，再进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

可以看出消化后的pHIS2-BADH2-pro质粒位于9000~10000bp之间符合预期，BADH2基因启动子已成功构建到pHIS2载体上。

按照0、10、20、30、40、50、75、100mmol的3-氨基-1，2，4-三唑浓度梯度，分别涂布含有pHIS2-BADH2-pro诱饵质粒和pHIS-p53+pGAD53m阳性对照的Y187酵母菌液，30℃恒温培养3d。

由自激活检测结果看出，在添加50mmol/L3-AT的平板上没有菌落生长，表明HIS3报告基因未激活，因此决定在50mmol/L3-AT的条件下进行酵母单杂筛选。

酵母单杂筛库及阳性克隆回转验证

将筛库平板上长出的初始阳性转化子划线于SD-Trp选择平板，30℃恒温培养3-4天，结果显示，共有96个单克隆菌落。

将选择平板上长出的阳性克隆转化子分别用无菌水稀释后点至SD-Trp缺陷平板，进行回转验证，所有阳性克隆均能在SD-Trp缺陷平板上生长。

酵母阳性克隆鉴定挑取阳性克隆菌落，并用2xYPDA液体培养基将所有筛选到的阳性克隆从平板上刮下，离心收菌后分别进行菌落PCR，经过Seqman拼接和BLAST比对，共筛选到39个与BADH2基因启动子互作的蛋白。

其中，rRNA合成装配相关蛋白3个、tRNA合成装配相关蛋白2个、mRNA剪切装配相关蛋白6个、细胞核蛋白3个、高尔基体相关蛋白2个、细胞壁相关蛋白3个。

次生代谢物合成分解相关蛋白5个、泛素化相关蛋白2个、运输蛋白2个、锌指转录因子2个、ABA信号转导相关蛋白1个、YABBY转录因子1个、钙调蛋白1个、膜鞘脂稳态相关蛋白1个、未知功能蛋白5个。

结合蛋白功能注释与启动子顺式作用元件预测分析，初步获得YABBY和A20型锌指蛋白两个互作转录因子。

香水椰子因其具有独特的芋香气味而深受消费者喜爱，市场潜力巨大，这么多年以来香水椰子香味关键基因BADH2已被发掘，但其上游调控机制还尚不清楚。

本研究通过酵母单杂交筛选到YABBY和A20型锌指蛋白两个可能的转录因子，为解析香水椰子香味的调控机理和优良香水椰子品种的创制提供分子基础。

总结

YABBY转录因子是种子植物特有的一类转录因子，其在植物侧方器官的远轴-近轴不对称发育、花分生组织发育和雄蕊维持中起重要作用。

此外，YABBY转录因子还参与了赤霉素生物合成和非生物胁迫应答调控，顺式作用元件预测分析显示，BADH2启动子含有YABBY转录因子结合位点，位于1497-1501处。

YABBY转录因子可能作为香味基因BADH2的上游调控因子，调控BADH2基因的表达，AN1/A20型锌指蛋白在植物盐、干旱和低温等逆境胁迫响应中起到重要作用，诱导表达多种非生物逆境胁迫响应基因。

已有研究表明，AN1/A20型锌指蛋白可作为转录因子，结合启动子MYB或GADOWNAT结合位点，调控基因表达。

甜菜碱醛脱氢酶本身具有响应逆境胁迫，将胆碱氧化产物甜菜碱醛转化为渗透保护剂甘氨酸甜菜碱的功能，且在BADH2基因启动子顺式元件预测结果中预测到大量MYB结合位点。

而AN1/A20型锌指蛋白很可能作为转录因子，调控BADH2基因的表达，但其具体结合位点还需进一步实验发现。